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Modelos embrionarios de la etapa de blastocisto del desarrollo temprano, reprogramados a partir de células de la piel. Crédito: Universidad de Monash

Las células en cultivo suelen formar láminas continuas, como la piel. Pero en 2017, el bioingeniero Jianping Fu se dio cuenta de que si cultivaba células madre humanas en un andamio 3D, se organizarían espontáneamente en estructuras que se verían, bajo un microscopio, un poco como un embrión.1. Los análisis de expresión génica sugirieron que las células eran similares a las de un embrión inmediatamente después de que se implanta en el útero, lo que significa que podrían servir como modelos experimentales para un punto previamente opaco en el desarrollo temprano.

"Una vez que el embrión humano se implanta en el útero materno, se vuelve invisible", dice Fu, de la Universidad de Michigan en Ann Arbor. "Ese marco de tiempo es realmente una caja negra". Pero es crucialmente importante. Esta etapa, alrededor de 7 a 10 días después de la fertilización en humanos, está marcada por la formación del saco amniótico y los primeros signos de la veta primitiva. Esa estructura marca el punto en el que el embrión establece los ejes del cuerpo y comienza a distinguir la cabeza de la cola y la izquierda de la derecha.

Los investigadores han buscado durante mucho tiempo observar y estudiar estas etapas de desarrollo. Pero trabajar con embriones humanos siempre ha sido técnica y éticamente tenso. Los modelos animales solo llegan hasta cierto punto para imitar a los humanos. Los embriones humanos naturales, donados por personas que se someten a un tratamiento de fertilidad, son difíciles de conseguir. Y hasta mayo de este año, a los científicos se les prohibió cultivar tales embriones en el laboratorio durante más de dos semanas después de la fertilización. La Sociedad Internacional para la Investigación con Células Madre (ISSCR) relajó esta regla de 14 días en mayo, permitiendo a los grupos de investigación en países donde dicho trabajo es legal solicitar permiso para continuar estudios más allá de los 14 días.

Dadas estas limitaciones, no es de extrañar que los investigadores hayan buscado alternativas a los embriones humanos naturales en el laboratorio. Las células madre de especies como los ratones han proporcionado durante mucho tiempo un reemplazo: células madre embrionarias (tomadas directamente de embriones en etapa temprana) o células madre pluripotentes inducidas (reprogramadas a partir de células adultas). Ahora, una nueva ola de modelos similares a embriones humanos se está poniendo al día. "Si queremos entender las características específicas del ser humano, realmente necesitamos mirar un sistema humano", dice Naomi Moris, bióloga del desarrollo en el Instituto Francis Crick en Londres.

Existen varios modelos similares a embriones. Incluyen blastoides, que imitan las etapas antes de que el embrión se implante en el útero, y gastruloides, que modelan la formación del plan corporal y los precursores de órganos. Otros incluyen tejidos que rodean al embrión, como el saco vitelino y la cavidad amniótica (el saco lleno de líquido que encierra el embrión), y algunos recapitulan los primeros pasos de la formación del cerebro, la médula espinal y el corazón, que ocurre alrededor del día 22 del desarrollo humano.

Los investigadores todavía están evaluando cuán similares son estos modelos a los embriones humanos: cuanto mayor es la similitud, mayores son los desafíos técnicos y éticos. Pero abren nuevos enfoques experimentales. "Por primera vez, podemos hacer pruebas genéticas y pruebas de detección de medicamentos en estructuras que son notablemente similares al embrión", dice Nicolas Rivron, biólogo del desarrollo en el Instituto de Biotecnología Molecular de la Academia de Ciencias de Austria en Viena. Tales pantallas podrían ayudar a identificar tratamientos para trastornos del desarrollo o infertilidad. Los modelos también podrían ayudar a separar cómo se forman los órganos, lo que podría conducir a avances en los trasplantes artificiales, por ejemplo.

"Estamos utilizando estos modelos para estudiar la embriología desde una perspectiva de abajo hacia arriba", dice Susanne van den Brink, bióloga del desarrollo de la Universidad Pompeu Fabra en Barcelona, España. "Es como estudiar cómo funciona un automóvil comenzando en las piezas más pequeñas y armándolo desde cero", dice.

Preimplantación

Entre las primeras etapas de desarrollo se encuentra una esfera hueca de células llamada blastocisto, que se desarrolla antes de la implantación, cuando el embrión humano comprende alrededor de 100 células.

Antes de 2018, los modelos de la etapa de blastocisto todavía eran rudimentarios. Entonces, al combinar dos tipos de células madre de ratón en matrices de micropocillos, Rivron y su equipo desarrollaron los primeros blastoides de ratón, estructuras de autoagregación que se asemejan a blastocistos de 3,5 días de antigüedad.2. Formados a partir de células madre embrionarias y células madre trofoblásticas, los blastoides revelaron que las señales de las células madre embrionarias regulan e inducen el desarrollo de células trofoblásticas, el progenitor de la placenta. (Este último grupo de células tiene un papel crucial en la mediación de la implantación uterina). "Esto es un poco contradictorio, porque durante el desarrollo posterior, es la placenta la que cuida del embrión", dice Rivron. "Pero en realidad, en estas primeras etapas, es todo lo contrario".

Varios equipos tradujeron el modelo blastoide a células humanas mediante el cultivo de células madre en un sistema de cultivo de pirámide invertida en 3D llamado AggreWell, disponible en Stemcell Technologies en Vancouver, Canadá. Informaron sus hallazgos este año. Por ejemplo, el biólogo de células madre Jun Wu en el Centro Médico Southwestern de la Universidad de Texas en Dallas y su equipo construyeron blastoides a partir de células madre embrionarias humanas tratándolas con factores químicos que inducen la señalización necesaria para el desarrollo de blastocistos. Encontraron que el mismo método funcionó en células madre pluripotentes inducidas por humanos generadas a partir de células de la piel reprogramadas.3. El biólogo de células madre Xiaodong Liu y sus colegas de la Universidad de Monash en Melbourne, Australia, también idearon un método para formar blastoides humanos a partir de células de la piel humana.4. Y Rivron y su equipo han desarrollado un modelo blastoide humano5.

A diferencia de algunos modelos de desarrollo humano como el de Fu, los blastoides contienen los tres linajes celulares que se encuentran en los embriones humanos naturales, no solo las células que forman el embrión en sí, sino también las "extraembrionarias" que conducen al saco vitelino y la placenta. "Los blastoides humanos representan los primeros modelos embrionarios completos o integrados establecidos a partir de células madre cultivadas", dice Wu.

Usando estos, Wu ha comenzado a explorar las señales moleculares que impulsan el desarrollo humano. Al tratar sus blastoides con inhibidores de diferentes versiones de una enzima llamada proteína quinasa C, por ejemplo, ha identificado qué isoformas específicas de la enzima impulsan la formación de la cavidad del blastocisto, el espacio lleno de líquido en su centro.3. "Las preguntas sobre la diafonía molecular y celular entre los tejidos embrionarios y extraembrionarios durante el desarrollo temprano solo pueden responderse con modelos integrados como los blastoides", dice.

Implantación y más allá

Múltiples grupos, incluidos los de Magdalena Zernicka-Goetz, bióloga del desarrollo y de células madre de la Universidad de Cambridge, Reino Unido, y el biólogo del desarrollo Yang Yu del Tercer Hospital de la Universidad de Pekín en Beijing, han utilizado modelos de blastocistos humanos para observar las etapas antes e inmediatamente después de la implantación (alrededor de 7-10 días después de la fertilización).6,7.

Estos modelos utilizan células madre pluripotentes extendidas o expandidas, que se derivan mediante la reprogramación de células madre para que puedan generar linajes celulares embrionarios y extraembrionarios. El crecimiento de estas células en placas de micropocillos piramidales invertidas en 3D con una combinación de crecimiento y otros factores químicos permitió que las células se agregaran en estructuras similares a blastocistos.

Luego, ambos grupos extendieron estos modelos a la etapa temprana posterior a la implantación al implantarlos en un andamio 3D llamado Matrigel que imita el entorno proteico y químico que rodea a las células. "[Matrigel] proporciona las señales para permitir que esas células madre se organicen, y nos permite imitar la transición que ocurre cuando un embrión se implanta en el cuerpo de la madre", dice Zernicka-Goetz.

Fu amplió sus modelos embrionarios post-implantación mediante el uso de sistemas de microfluídica de bioingeniería hechos de tres canales: un gel central que imita la pared uterina y un canal cada uno para entregar células madre y señales químicas de una manera controlada con precisión. El sistema era lo suficientemente escalable como para producir cientos o incluso miles de estructuras similares a embriones, informaron él y su equipo en 2019.8. Este enfoque de microfluídica también aumentó la eficiencia y la reproducibilidad, dice, lo que hace que los modelos sean particularmente convincentes para aplicaciones traslacionales como la detección de drogas y toxicidad.

Fu utilizó sus modelos para demostrar que ciertos aspectos del desarrollo embrionario humano, como la diferenciación de las células que forman la capa más interna de la placenta (el amnios) de las células madre, son particularmente sensibles a la rigidez mecánica y la naturaleza 3D de la matriz en la que se cultivan.8. Cambiar el grosor de la matriz de gel o cultivarla en cultivo 2D en lugar de 3D impidió la diferenciación adecuada de amnios. "Tal conocimiento solo se puede generar, a partir de este momento, a partir de modelos in vitro, porque in vivo,es muy difícil realizar estudios mecanicistas de este tipo", dice.

Pasando el día 14

En la tercera semana de desarrollo humano (14-22 días después de la fertilización), el patrón principal del cuerpo emerge en un proceso llamado gastrulación. También lo hacen las tres "capas germinales": el endodermo que da lugar al intestino y los órganos internos, el mesodermo que forma el músculo y el tejido conectivo, y el ectodermo, que crea la piel y el sistema nervioso. "Estas capas germinales son los precursores de todos los órganos y todos los tipos de células del cuerpo, por lo que es realmente crucial comprender cómo se produce la diferenciación celular", dice Berna Sozen, bióloga del desarrollo de la Escuela de Medicina de Yale en New Haven, Connecticut.

Los biólogos del desarrollo Ali Brivanlou y Eric Siggia de la Universidad Rockefeller en la ciudad de Nueva York desarrollaron los primeros modelos de gastrulación en 20149. Los modelos "imitaban un período de nuestro desarrollo que nunca antes habíamos visto, y esta fue una de las cosas más hermosas", dice Brivanlou.

Pero esas eran estructuras 2D. Van den Brink desarrolló los primeros modelos 3D de gastrulación en ratones, llamados gastruloides, mientras trabajaba con el biólogo del desarrollo Alfonso Martínez Arias en la Universidad de Cambridge. Los investigadores descubrieron que el crecimiento de pequeños agregados de células madre de ratón con las señales correctas, como los activadores de la vía de señalización Wnt, hizo que se diferenciaran en estructuras similares a embriones que se asemejan a la etapa de gastrulación.10. "Forman un eje cabeza-cola, el eje espalda-vientre y el eje izquierda-derecha, y forman todos los progenitores de órganos en la ubicación correcta", dice van den Brink.

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                                                  Los modelos embrionarios gastruloides se utilizan para estudiar la formación del cuerpo y los órganos. Crédito: Naomi Moris

Los investigadores habían pensado previamente que, para formar el eje cabeza-cola, el embrión tenía que estar rodeado y recibir señales de tejidos extraembrionarios, de los que carecen los gastruloides, dice. "Ese es un muy buen ejemplo de cómo estos modelos están empezando a desafiar nuestros libros de texto sobre embriología".

En 2020, mientras trabajaba como estudiante graduado con Martínez Arias, Moris tradujo esa tecnología a los gastruloides humanos, descubriendo que sus patrones de expresión génica aproximadamente "seguían el eje de cabeza a cola en estas estructuras", dice.

Al comparar la morfología gastruloide con las colecciones curadas existentes de embriones humanos, Moris pudo colocar su sistema modelo aproximadamente en el día 20-21 días después de la fertilización, cuando comienzan a aparecer estructuras llamadas somitas, que dan lugar a la columna vertebral y algunos músculos.11. "Estas estructuras no solo recapitulaban algo que sabíamos que sucedía en el desarrollo de los mamíferos, sino que también nos permitían poner un alfiler realmente donde estaban en la línea de tiempo del desarrollo humano", dice. Por lo tanto, estos modelos podrían ser útiles para replicar estas etapas posteriores del desarrollo humano.

Los investigadores ahora han impulsado los modelos de gastruloides aún más. Brivanlou, por ejemplo, ha desarrollado modelos 3D de tejido cerebro humano temprano, denominados neuruloides.12. Al incrustar gastruloides en Matrigel, van den Brink generó modelos similares a embriones de ratón que forman somitas.13. Y Jesse Veenvliet, biólogo del desarrollo en el Instituto Max Planck de Biología Celular Molecular y Genética en Dresde, Alemania, generó modelos embrionarios de ratón con somitas y un tubo neural, la estructura que eventualmente forma la médula espinal.14.

"Podemos usar el gastruloide original que no tiene un tubo neural como una pizarra en blanco y luego comenzar a agregar señales encima, por lo que realmente podemos comenzar a diseccionar adecuadamente las entradas mínimas que se necesitan para obtener una arquitectura similar a la de un embrión de mamíferos", dice Veenvliet. Los investigadores pueden incluso capturar el desarrollo embrionario a medida que se desarrolla, en vivo en la cámara, dice.

Aplicaciones variadas

Estas herramientas podrían ayudar a los investigadores a comprender cómo el desarrollo va mal. La creación de modelos similares a embriones humanos a partir de las propias células de la piel de una persona podría permitir a los científicos explorar los impactos de la genética de ese individuo en el desarrollo, por ejemplo.

Investigadores como Rivron están utilizando modelos organoides del revestimiento del útero para desarrollar modelos de implantación detallados, que podrían ayudar a revelar las causas de la infertilidad y la pérdida temprana del embarazo, y podrían conducir a nuevas terapias. "Podemos recapitular ahora, en un plato, aquellos procesos que normalmente ocurren muy bien escondidos en el útero", dice Rivron.

Los modelos de embriones humanos también podrían usarse para detectar la toxicidad de los medicamentos. En un estudio de prueba de concepto, Moris ha demostrado que el medicamento talidomida, infame por causar defectos de nacimiento en humanos, pero no particularmente tóxico en ratones, tuvo un efecto más fuerte en los gastruloides humanos que en los gastruloides de ratón, lo que sugiere que estos modelos podrían ser útiles para pantallas toxicológicas específicas de humanos.15.

Los modelos similares a embriones humanos podrían incluso algún día conducir a avances en la medicina regenerativa, como la capacidad de generar órganos y tejidos artificiales para trasplantes, dice Fu. Los modelos basados en células madre pluripotentes derivadas de pacientes podrían cultivar órganos artificiales que el cuerpo reconoce como propios. "Ese es realmente el santo grial de la medicina regenerativa", dice Fu.

Desafíos técnicos y éticos

Los modelos similares a embriones generalmente se pueden hacer en 3-9 días utilizando consumibles y protocolos listos para usar, y habilidades estándar de cultivo celular. "Tienes que colocar las células en placas y luego darles las señales correctas, pero aparte de eso, en su mayoría es solo esperar", dice van den Brink. La eficiencia es a menudo baja, con solo el 5-20% de las colonias celulares que se convierten en modelos completamente formados, pero algunas estrategias funcionan mejor. Los modelos basados en microfluídica de Fu, por ejemplo, pueden superar el 90% de eficiencia, aunque requieren experiencia especializada en bioingeniería.

Comience con células de alta calidad, aconseja Rivron. "Tener células madre prístinas para empezar es absolutamente crucial". Eso significa usar células que no se han cultivado durante demasiado tiempo y mantenerlas lo más saludables posible. "Cultivarlos es una especie de arte", dice.

Los protocolos existentes proporcionan un buen punto de partida, pero prepárese para ajustar las condiciones experimentales para obtener resultados óptimos. "Si tienes experiencia en cultivo celular, entonces puedes aprender a hacer gastruloides en aproximadamente dos semanas", dice van den Brink.

Una vez que hayan crecido, asegúrese de comparar sus modelos con embriones naturales utilizando tanto microscopía como análisis de expresión génica de una sola célula, para asegurarse de que sean lo que parecen ser. "Las apariencias pueden ser engañosas", dice Rivron. "Tienes que ser capaz de entender las células que formas y compararlas con las células del embrión", dice.

Tales comparaciones se vuelven más difíciles después del día 14, porque tales experimentos fueron completamente prohibidos hasta principios de este año, y aún siguen siendo técnicamente desafiantes. Pero eso podría cambiar a medida que las técnicas mejoren y los laboratorios soliciten excepciones a la regla del día 14. "Sería muy útil y definitivamente nos permitiría validar el sistema gastruloide humano", dice van den Brink.

Pero las consideraciones éticas también se vuelven más complicadas pasado el día 14. Las últimas directrices del ISSCR diferencian entre los modelos que contienen solo una parte del embrión, como los gastruloides, y los que contienen los tres linajes celulares, como los blastoides. Estos últimos modelos están sujetos al mismo proceso de revisión intensiva que los embriones naturales antes de que puedan ser estudiados más allá del día 14.16. "También hay un consenso de que ninguno de los modelos debe usarse con fines de reproducción humana, y ninguno de los modelos, ya sea que estén completos o no, debe usarse para la implantación", dice Fu, quien ayudó a redactar las pautas.

A medida que los modelos humanos de embriogénesis mejoren, las discusiones éticas adicionales solo se volverán más importantes. "Esto está avanzando ahora con una velocidad que ni siquiera podría haber imaginado hace unos años", dice Brivanlou.

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Fuente

 

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